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蛋白質的化學修飾ppt

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蛋白質的化學修飾ppt

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這是蛋白質的化學修飾ppt下載,主要介紹了概述;蛋白質功能基的超反應性;控制修飾反應的專一性;確定修飾程度和修飾部位;化學修飾結果的解釋;蛋白質側鏈的修飾;羧基的修飾,歡迎點擊下載。

一、概述指在溫和條件下,蛋白質側鏈基團與化學試劑形成專一性共價鍵的反應。涉及蛋白質側鏈及修飾劑的反應性兩個方面 化學修飾的意義 改造蛋白質,改善其功能性質,使適用于更廣泛領域;科學研究,例如酶的活性中心,致病性,藥物生物大分子相互作用、藥物設計等。特別注意:被修飾蛋白質側鏈基團的親核性與其pK值相關。 影響蛋白質側鏈基團pK值的因素有: ⑴微區極性決定基團解離狀態的關鍵因素之一。例如,溶菌酶中第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9;當其與抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結合后,此時Glu35的γ-羧基pKa=6.4,上升了0.5。可能是由于抑制劑的加入,改變了該酶的構象,使該殘基微區極性降低之故。蛋白質構象改變會導致微區極性的局部改變,這種改變對 Trp,Met和Cys的反應性影響最小; 對氨基和咪唑基的反應性影響較大; 而對Tyr,Hcys和COOH的反應性影響最大。此外,極性的變化也影響到反應類型。 ⑵氫鍵效應氫鍵對維持天然蛋白質及其離子穩定性有重要影響,氫鍵的變化也可能導致pK發生改變。例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH單位,這是由于氯與酚基形成氫鍵的能力比溴強。水楊酸的羧基可與其酚基形成氫鍵,結果使其羧基的pK值比正常值小1個pH單位,同時使酚基的正常pK10改變到pK13,因此,在蛋白質的酚基-羧基相互作用中,羧基的pK值應比正常值低,而酚基的pK值高于正常值。 ⑶靜電效應蛋白質中組氨酸殘基的pK值是不同的。例如,碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個組氨酸殘基,pK值分別是:碳酸酐酶: 5.91 6.04 7.00 7.23 葡萄球菌核酸酶: 5.37 5.71 5.74 6.50 組氨酸在這兩個蛋白質中的pK值范圍是5.37~7.23,幾乎相差2個pH單位,可能是鄰近帶電基團相互影響所致。總之影響蛋白質可解離氨基酸側鏈pKa值、可影響這些側鏈基團的反應性。蛋白質功能基的微區狀態不同,反應性不同。功能基反應性差異可通過競爭標記法來測定。 ⑷位阻效應蛋白質表面的側鏈基團旁有烷基等較大基團時,有基團空間位阻,影響與修飾劑接近及反應。例如,枯草桿菌蛋白酶的所有10個Tyr殘基均在分子表面,而且其酚羥基幾乎都不形成氫鍵。對它進行徹底硝化和碘化,10個Tyr中也只有8個被修飾,這很可能是空間障礙所引起的。此外,電荷轉移,共價鍵形成,金屬鰲合等都會改變蛋白質功能基的反應性。 ⒉蛋白質功能基的超反應性超反應性是指蛋白質中的某側鏈基團與某試劑發生反應的能力。超反應性基團一般與蛋白質的某種功能性有關。超反應基團并不一定在酶的活性中心。例如,木瓜蛋白酶中的19個Tyr殘基中只有一個能與二異丙基氟磷酸反應,該殘基被修飾后并不一定使酶活性發生改變。修飾劑修飾蛋白質反應的活性由以下因素所決定: ⑴選擇吸附修飾劑與蛋白質功能基之間的選擇性吸附越強,反應性越大。 ⑵靜電相互作用帶電荷的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質表面帶相反電荷的某一殘基定位。 ⑶位阻因素蛋白質表面的位阻,或底物、輔助因子、抑制劑產生的位阻都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應。例如,α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12,而且反應很快;若用α-溴代戊酸修飾,則很難進行反應;α-溴代己酸則不能發生反應,這顯然與位阻有關。 ⑷催化因素修飾部位附近的其它功能基,若有酸堿催化作用,也能影響修飾反應。例如,對硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽以同一機理對胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸進行乙酰化,但苯乙酸鹽反應性差,這與酶的酸堿催化有關。硝基苯乙酸鹽對絲氨酸酶的反應性較高,這與Ser附近的路易斯堿與羧酸羥基氫作用,削弱該氧原子對羧基碳的吸電子相互作用有關。 ⑸局部環境的極性溶劑極性可能與反應速度有關,如下表: 反應類型 降低極性對速度的影響 ⒈RSR+ICH2CONH2 [R2S+CH2CONH2]I- 適當或大大降低 ⒉RSR+H2O2 R2SO+H2O 沒有影響 ⒊RS-+ ICH2CONH2 R2SCH2CONH2+I- 沒有影響 ⒋RN+H3+OCN- RNHCONH2 適當或大大增加疏水環境能阻止產物電荷分離的反應(反應1),并能加速電荷中和的反應(反應4);對于反應2(沒有電荷分離)和反應3,電荷只是從一個離子轉移到另一個離子,則介質是的極性是不重要的。二、化學修飾的方法學進行蛋白質修飾時,首先是選擇修飾劑和修飾條件,以期提高修飾反應的專一性,獲得滿意的修飾結果。其次,在修飾反應過程中,要建立適當的方法追蹤反應進程,以獲得與修飾有關的數據。然后分析獲得的數據,確定修飾部位和修飾程度,提出對修飾結果的合理解釋。一、控制修飾反應的專一性探索性研究時,對修飾對象的了解不多,所以選擇修飾劑和修飾條件至關重要,選擇的正確性直接影響到修飾反應的專一性和有效性。 ⒈試劑選擇不同實驗,對修飾的專一性要求也不同,因此選擇試劑在很大程度上要依賴修飾目的。例如,對氨基的修飾,僅修飾氨基;僅修飾α-氨基;修飾暴露的或反應性高的氨基。一般通過選擇試劑和反應條件來控制修飾的部位和程度修飾對有機溶劑不穩定的蛋白質,必須在水介質中進行,應選擇在水中有一定溶解度的試劑。在選擇試劑時,應考慮反應生成物容易進行定量測定,即有特殊的光吸收或同位素標記等。選擇試劑時,應注意其體積,體積過大,引起的空間障礙大,而不能或不易與作用的基團接近。一般而言,試劑體積較小為宜。選擇試劑時,應該考慮修飾反應要達到的程度;修飾后蛋白質構象是否基本保持不變;是否需要分離修飾后的衍生物,反應是否需要可逆等因素。總之理想的修飾酶活性部位氨基酸殘基的試劑應該具備以下特征: 即選擇性地與一個氨基酸殘基反應;反應須在酶蛋白不變性的條件下進行;標記的殘基在肽中穩定,易通過降解分離并進行鑒定;反應程度可用簡單的技術測定。但是,一種試劑往往不能同時滿足上述所有條件,所以必須根據具體實驗要求進行取舍。 ⒉選擇反應條件修飾蛋白質的反應條件,除允許修飾反應能順利進行外,還必須滿足:不造成蛋白質的不可逆變性; 有利于專一性修飾蛋白質。為此,應盡量控制反應的溫度、pH值、反應介質和緩沖液等,以保證蛋白質特定空間構象盡量不變。 ⒊反應的專一性專一性對蛋白質的化學修飾至關重要,用以下途徑可以保證修飾的專一性: ⑴選擇專一性試劑蛋白質分子的特殊空間結構能影響其某些基團的活性。例如DFP能與胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸作用,導致酶迅速失活。 ⑵選擇不同的反應pH 均受pH的影響,控制反應pH值,可調控蛋白質分子各功能基的解離程度,從而控制修飾反應的專一性。例如,用碘乙酸或其酰胺可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側鏈及α-氨基、ε-氨基發生作用;pH6時,它只專一的與組氨酸的咪唑基作用;pH值為3時,專一與Met作用(在酸性下,巰基和氨基都呈正離子,不活潑)。 ICH2COOH+蛋白質-SH 蛋白質-S-CH2COO-+H++I- (pH>7) ICH2COOH+蛋白質-S-CH3 蛋白質-S(-CH3)-CH2COO-+I- (pH3) ICH2COOH+蛋白質-NH2 蛋白質-NH-CH2COO-+H++I- (pH>8) ICH2COOH+蛋白質-His 蛋白質-His(N-CH2COO-)+H++I-(pH6) ⑶利用某些產物的不穩定性高pH下,用氰酸、二硫化碳、O-甲基異脲和亞氨基酸等可轉變氨基成脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用,但因pH高,形成的產物迅速被分解。 ⑷親和標記親和試劑先以非共價鍵結合到蛋白質的活性部位,再發生化學作用。因此親和標記試劑必須與蛋白質作用的底物或抑制劑相似,可順利到達修飾位點,而且還能與特定活性基團反應。例如,利用對甲基苯磺酸氯(CH3-C6H4-SO2Cl),就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上。 ⑸差別標記以底物或抑制劑保護蛋白質的活性部位基團,使其不能與修飾試劑作用,可修飾非必需基團。然后將過量的底物或抑制劑除去,獲得部分修飾的蛋白質。將其與同位素標記的同樣試劑作用,則獲得帶有放射性同位素標記的蛋白質活性中心基團。 ⑹利用蛋白質狀態的差異在不同狀態下,蛋白質的構象有差異,暴露的基團也不同,因此在不同狀態下修飾,可獲得相關信息。例如,在結晶狀態下修飾,可提高修飾的專一性。核糖核酸酶在晶體狀態下進行羧甲基化時,反應主要集中在His119,而對His12的修飾則很少,兩者之比為60∶1;在溶液中該反應的比例為15∶1。二、確定修飾程度和修飾部位通過對被修飾蛋白質的降解和氨基酸分析后鑒定修飾部位。通過純化被修飾蛋白質的氨基酸及其衍生物,測定其同位素標記量或光譜強度或順磁共振譜或熒光標記量等來確定反應程度。一般認為:測定被修飾的氨基酸,要比測定氨基酸的減少量更準確。三、化學修飾數據的分析 ⒈化學修飾的時間進程曲線以修飾時間對蛋白質活性作圖可以了解修飾殘基的性質和數目,修飾殘基與蛋白質活性的關系,實際上是蛋白質失活速度常數的測定若蛋白質活性僅與某個殘基有關,則可用公式(后面)表示 Log E1/E0 = - K失活·t E1為時間t時的活力,E0為初始活力, E1/E0為時間t時的殘余活力若蛋白質活力與兩個以上的殘基有關,而且與修飾劑反應速度不相同,可獲得多相修飾半對數圖 ⒉確定必需基團的性質和數目蛋白質分子中某些側鏈基團在功能上雖有必需和非必需之分,但它們往往都能與某一試劑起反應。 1961年Ray等提出用比較一級反應動力學常數來確定必需基團的性質和數目的方法,但是該法的局限性大,現基本被放棄。當n為已知時,x可由實驗測得的m值計算而得。由上式兩邊取對數,以logα對log x作圖得直線,其斜率即為必需基團數i。當n為未知時,x無法求得,但可根據上式給定一系列的i值(1,2,3……)。使得α1/i對m作圖為一直線的那個i值。蛋白質分子中的必需基團和非必需基團與修飾劑的作用速度明顯不同,假定該基團總數為n,并將其分為三類;一類是反應速度最快的必需基團,總數為s,二是p個反應速度較慢的基團,其中i個必需基團;三是反應最慢的基團,其數目為(n-p-s)。這時,活力的變化與修飾程度間的關系是: α1/i=(p +s - m)/ p或α1/i=(n/p)x -(n-p-s)/p,其中,m是被修飾的基團數,x=(n-m)/n為基團剩余分數。以α1/i對m或x作圖,可以確定必需基團數i,也可由斜率和截距求得p和s。鄒氏方法為蛋白質化學修飾研究由定性描述轉入定量提供了理論依據和計算方法,可用于蛋白質設計。四、化學修飾結果的解釋 ⒈蛋白質功能改變 ⑴確認試劑已經作用于蛋白質; ⑵確認修飾蛋白質的構象是否發生顯著變化; ⑶確認修飾發生在何處,常用的方法有: ①修飾發生在活性部位的必須基團,蛋白質活性的喪失與修飾程度存在一定的化學計量關系。 ②底物保護與修飾蛋白失活程度的關系分析。 ⒉注意分析修飾殘基的穩定性許多反應,如酰基轉移、巰基轉移、鹵素轉移及二硫鍵交換過程可能自發地或在純化、降解過程中發生。例如,蛋白質中的碘代酪氨酸除對光和氧敏感外,在層析或在弱酸性介質中,有碘離子存在時,能發生脫碘化作用。又如,光敏化的組氨酸經酸水解后,產生許多未知產物,但這些未知產物峰的位置與正常氨基酸的峰位重疊。應引起特別注意,以區分修飾的真偽。四、蛋白質側鏈的修飾蛋白質側鏈上的功能基主要有;氨基、羧基、巰基、吲哚基、胍基、甲酰基等,修飾上述每一種功能基都有好多種試劑可以利用,這里不再介紹。僅介紹那些應用廣泛,又能達到某種特殊目的的試劑,并且以專一性為主。 ⒈氨基的修飾氨基的修飾可分為三類:引入正電荷的修飾;電荷消失的修飾;引入負電荷的修飾。賴氨酸的ε-NH2以非質子化形式存在時很活潑,可被選擇性修飾 ⑴引入正電荷的修飾下列試劑修飾氨基后,在賴氨酸側鏈上留下可電離的帶正電基團 ①還原烷基化醛與賴氨酸側鏈反應形成席夫堿,再用硼氫化鈉還原席夫堿,獲得穩定衍生物 E-NH2 + RCHO E-NH-CHR E-NH-CH2R 所用的醛可有不同的R基團,如甲醛、乙醛、丙醛等,用這些試劑修飾,可獲得側鏈微環境方面的信息 ②用烴基亞酰胺脒化(例如甲基乙亞酰胺)反應所產生的衍生物在酸、中性pH下穩定,在堿性pH下不穩定 ⑵消除電荷的修飾這類試劑可抑制賴氨酸的ε-NH2的質子化,使形成的衍生物不帶電。 ①乙酰化在微堿性pH下,乙酸酐很容易與氨基作用,但是乙酸酐此時也能與巰基和咪唑基發生反應,應在較低溫度下進行。 ②甲氨酰化作用氰酸鹽與氨基反應形成非常穩定的衍生物,同時能與巰基、酚基、羧基、咪唑基發生反應,然而,除氨基衍生物外,其余反應產物在微堿性(pH~8)條件下不穩定,該反應應用廣泛,一個明顯的優點是氰酸鹽離子體積小。 ⑶引入負電荷的反應 ①磷酸吡哆醛修飾磷酸吡哆醛修飾專一修飾氨基,賴氨酸殘基在中性pH下與磷酸吡哆醛(PLP)反應,形成希夫堿,再用硼氫化鈉(NaBH4)還原,得賴氨酸的不可逆修飾物,此產物不僅帶負電,而且在325nm處有最大吸收,可用于定量測定。產物還有強烈熒光。 ⑵酰化反應 ⒊精氨酸胍基的修飾具有鄰位羰基的化合物可與精氨酸的胍基形成穩定的雜環產物,常用的試劑有丁二酮,苯甲酰甲醛和乙二醛。雖然胺或巰基也能與試劑作用,但在中性pH下,其反應速度遠比胍基慢。在碳酸氫鹽緩沖液中,苯甲酰甲醛與精氨酸反應較快,而α-NH2在同樣條件下不反應。 ⒋羧基的修飾用水溶性碳二亞胺專一修飾蛋白質中的羧基。在這個修飾中,碳二亞胺先活化羧基,活化的中間體通過O N酰基轉移而重排,或者與加入的親核物形成相應的酰胺,該法應用廣泛。絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸在一定條件下也能發生該反應 ⑸巰基的修飾半胱氨酸是蛋白質中反應性最強的殘基,所以很多試劑可用來修飾巰基側鏈,常用的試劑有三類,即碘乙酸和碘乙酰胺或環乙烯亞胺;馬來酰亞胺或馬來酸酐;有機汞試劑如對氯汞苯甲酸,其反應分別如下 ⑹組氨酸咪唑基的修飾常用試劑是焦磷酸二乙酯和碘乙酸,用碘乙酸烷化組氨酸殘基可獲得單取代或雙取代的衍生物焦碳酸二乙酯修飾組氨酸特別有用,它在中性pH下有較好的專一性,能使咪唑環上的一個氮原子羧乙基化,產物在240nm處有最大吸收,可用來追蹤反應和定量測定。 ⑺色氨酸吲哚基的修飾 N-溴代琥珀酸亞胺(NBS)常用來修飾色氨酸,它使吲哚基氧化成為羥基吲哚衍生物,導致吲哚基在280nm處的吸收值降低。該反應必須小心進行,若濃度過大,可使修飾的色氨酸殘基處的肽鍵斷裂。此外,酪氨酸也能與NBS作用并干擾吲哚基的測定。各種芐基鹵化物能使吲哚基環烷基化,最常用的是2-羥基-5-硝機基芐基溴及其類似物二甲基(2-羥基-5-硝基芐基)锍鹽。這些試劑在沒有半胱氨酸殘基時,對色氨酸是很專一的五、化學交聯技術在蛋白質研究中的應用定義:用雙功能試劑或交聯劑將兩個分子結合起來的化學反應。在蛋白質中,其肽鏈末端基團及側鏈親核基團都是交聯的功能基,因此,交聯技術廣泛用于研究蛋白質的活性基團。目前,交聯仍是研究蛋白質活性基團等的最有效,最多樣化的技術之一。該技術可用于研究蛋白質的相互作用,不但可以確定蛋白質的相鄰亞基,還可以確定相互作用蛋白質間的最大間距等。在交聯時要使用交聯劑(包括使用酶)必須注意兩點:交聯是一個經驗過程,無法預測哪種蛋白質在何種條件下與何種交聯劑發生反應,需要對各種實驗條件及試劑進行篩選以獲得最佳交聯效果;其次,對未發生交聯的原因解釋要極其謹慎,即遵守“無證據并不證明不存在”的格言。對于兩個發生交聯的相互作用蛋白質,其功能基團如側鏈,需要正確定位且有足夠的活性,才會被適當的交聯劑所修飾。 ⒈體內與體外交聯反應的特點交聯法既可在體外、也可在體內進行。在體內,蛋白質組分的復雜性及集中度要遠遠大于體外環境,因此,應使用短交聯劑就可達到交聯鄰近的蛋白質的目的。 ⑴體內交聯的特點在體內,只有有相互作用關系的蛋白質之間才可能“臨近”,因此體內交聯更具有特異性。在體內交聯研究時,通常使用脂溶性疏水性交聯劑,例如甲醛,CS2,碳化二亞胺等,他們可以穿過細胞膜。但是,一定要注意到:要確定或控制細胞內交聯特異性最適合條件是極其困難的;此外,交聯劑可以與大量其它蛋白質相互作用,其中包括細胞表面蛋白,整合膜蛋白,胞漿內蛋白及核蛋白。而且代謝產物及非蛋白組分也是交聯劑的潛在競爭劑,特別是當它們具有與蛋白質側鏈同類的反應基團時,如胺類、羧化物或者硫醇。 ⑵體外蛋白質交聯的特點在體外交聯更有可能同時控制交聯的特異性及條件。例如,水溶性及脂溶性的交聯劑可分別用于修飾相互作用的親水區及疏水區。pH、反應物濃度及反應溫度也易于控制。體外交聯還允許對蛋白質及其復合物的純度進行優化,以使蛋白質的交聯模式更易解釋。體外交聯的另一個優點是有大量的交聯劑可以選擇。 ⑶注意事項必須以交聯目的來選擇交聯方法。例如,想要說明整合膜蛋白質的相互作用最好選用體內交聯方法;研究細胞因子受體之間的相互作用是在激活配體的情況下將細胞表面受體交聯,可在體外進行;而包漿內蛋白質之間的相互作用則既可在體外、又可在體內進行。只要有可能應盡量選用體外法進行交聯。即使是在最適條件下進行交聯反應,反應體系中也至少會產生三種不同的共價修飾形式,分別為單取代蛋白、分子內交聯及分子間交聯。單取代蛋白是指蛋白質僅被交聯劑中的一個活性基團修飾時所形成的單取代連接分子內交聯是指蛋白質或交聯劑的濃度較低、或交聯劑的長度只能在同一蛋白質內,而不是鄰近空間相鄰側鏈形成交聯橋時,易形成單個多肽鏈的分子內交聯當交聯劑的幾何形狀、化學性質、柔韌性、跨度均適合于共價連接兩個分離蛋白的反應側鏈時,則形成分子間交聯蛋白質含有大量有活性的氨基酸側鏈基團,可以被不同類型的化學交聯劑選擇性識別。氨基酸分為疏水的脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和親水的極性氨基酸,除少數例外,均是第二類氨基酸中的親核側鏈參與交聯。 ⒉pH的影響大部分交聯反應都是親核取代反應,其中,對親核氨基酸側鏈的攻擊使一對電子轉移至交聯劑,造成交聯劑離去基團的直接取代并在交聯劑與蛋白質側鏈間形成了共價鍵。所有這種親核取代發生的反應速率依賴于交聯劑的離去基團是否易被置換以及攻擊側鏈的親核性。在蛋白質中發現的最有效的親核側鏈是R-S-,即陰離子的半胱氨酸去質子化硫酸鹽。質子化會減低該基團及其它可電離的反應側鏈作為電子對提供者的有效性,從而降低其親核性。因此,pH是影響交聯反應的最重要因素。例如pH從其pka上升兩個單位,則去質子化側鏈的百分比將從50%升至99%,反應活性也相應升高。 ⒊交聯劑的類型最普通的化學交聯劑是雙功能試劑,即具有兩種化學反應基團,可以與蛋白質靶的兩條側鏈發生反應,從而形成交聯復合體的化合物。交聯劑中將這兩個反應基團相連接的部分稱為間隔段或接合部。該間隔段除了確定著兩個反應基團的距離外,還提供了其它重要特征。例如,間隔段內含有二硫鍵,就會對于還原劑產生的化學裂變異常敏感,這種化合物稱為可裂變交聯劑。間隔段也為分析交聯劑的幾何學參數及溶解性提供線索。同型雙功能或異型雙功能交聯劑具有相同或不同反應基團的雙功能交聯劑分別稱為同型雙功能或異型雙功能交聯劑,異型雙功能交聯劑的優勢在于可以用不同功能的基團選擇不同類型的親核側鏈,而且可以使兩步交聯反應在不同的條件下單獨進行。零距離交聯劑這種交聯劑可以激活靶蛋白側鏈的功能性基團,無須插入任何外源間隔段即可在側鏈間形成共價鍵。應用最多的零距離交聯劑是碳二亞胺,它激活羧基形成活化的酰化異脲中間體,繼而被胺類修飾,與氨基與羧基間形成酰胺鍵。氰也能將相互作用蛋白質之間的鹽橋賴氨酸酰基與酸性氨基酸共價連接。由于氰是一種氣體試劑,可以輕易穿過細胞膜,因此可以用于體內交聯,轉谷氨酰胺酶是另一種,催化相互作用蛋白質的谷氨酰基與賴氨酰基間形成異肽鍵. 交聯的特異性及選擇性交聯的特異性是指通過交聯檢測到的蛋白質間可能發生的相互作用選擇性是指交聯劑對某種特定的氨基酸側鏈的專一程度。特異性與選擇性密切相關,選擇性低的交聯劑會造成大范圍的修飾,因此其特異性低。用交聯劑方法判斷相互作用蛋白質時,控制交聯的特異性是最關鍵點之一。在一步交聯反應中,更是如此。否則,額外的交聯極易發生,造成許多假陽性。例如pH高于8的交聯反應,易去質子化并激活蛋白質表面許多親核基團,使得蛋白質象一個棉球一樣,吸附交聯劑結合并最終吸附反應過程中與其接觸的溶質分子,當交聯劑的濃度遠遠高于靶蛋白時,這種情況也會發生。利用異型雙功能交聯劑反應基團的不同特性而產生兩步交聯反應,用于提高交聯的特異性。在這種反應中,首先感興趣的純化蛋白常常被光活化異型雙功能交聯劑的化學反應基團修飾,過量的未共價連接的交聯劑隨即從被修飾蛋白中去除;第二步,這種單衍生化的蛋白質與其可能的蛋白質相互作用在一起,暴露于激發波長的光波中以形成交聯。交聯的特異性及間距(分子標尺及近鄰法) 我們設想,聚合體中的蛋白質亞基只有在足夠臨近時才能發生具有生物學功能的相互作用,在此時研究蛋白質分子之間相互作用的方法就叫做臨近法。這時就要利用一系列的同源交聯劑來考察其作用間距。若待交聯的親核基團間的間距大于交聯劑的長度,就無法實現交聯,因此交聯的特異性依賴于交聯劑反應基團之間的距離。測定活性氨基酸殘基間最大距離的基本方法是采用一系列同源的不同長度的間隔段或幾何形狀的交聯劑來加以測定(即分子標尺)只有在保持同源的交聯劑活性基團一致的情況下,才能排除交聯劑在化學反應上的差異,從而簡化對實驗后果的分析。這種用分子標尺法確定的反應基團間的距離稱為最大間距。因為距離小于交聯劑伸展長度的反應基團也會由于交聯劑可能的柔性而發生交聯,而蛋白質的微動可能會使交聯殘基的間距測定更加復雜。交聯篩選的流程圖在交聯篩選的流程圖中,要注意以下幾方面的程序,它們分別是,制備樣品,對體內實驗來說,蛋白質的數量一般要達到0.5-1億個分子,(凝膠染色或免疫化學),若要使細胞內蛋白與將要進行交聯的蛋白易于區分,還可在后者分子上進行標記,并將細胞外其他可能與內部蛋白交聯的干擾物質用緩沖液洗去;對于體外反應要將蛋白質再不可能與交聯劑反應的緩沖溶液中溶解或透析至終濃度0.05-0.5mg/mL,使pH達到7.5左右。篩選交聯條件應注意:疏水交聯劑要用合適的溶劑溶解(如碳二亞胺用乙醇),但應盡量配成濃度較大,使交聯劑溶液加入量不超過總體積的15為宜,一般交聯劑:蛋白質比例在10-100之間;控制溫度、pH為最佳狀態,一般情況下,堿性利于氨基交聯,而低于中性pH則有利于巰基交聯。交聯反應滅活或淬滅這是交聯反應的最后一步,就是向反應體系中加入可以與交聯劑反應基團相競爭的過量親核試劑,例如甘氨酸和Tris或其它試劑以避免額外的蛋白質交聯。也可以加入SDS緩沖液進行漩渦振蕩并在90度加熱5分鐘終止反應,還可以用蛋白質沉淀劑(如三氯乙酸、硫酸銨或聚乙二醇)。

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